Sammanfattning

Nästa generations sekvensering är en teknik som används för att bestämma sekvensen av genetiskt material (DNA eller RNA) för att få insikt i den genetiska variationen i samband med sjukdomar som cancer. Nästa generations sekvensering finner sin tillämpning vid upptäckt av cancermutationer, genetisk testning för ärftlig cancer, personlig cancerbehandling, upptäckt av cirkulerande cancer-DNA. Nästa generations sekvensering kan användas för att testa flera cancerspecifika markörer samtidigt, vilket sparar pengar, tid och patientprover.

Vad är nästa generations sekvensering?

Nästa generations sekvensering (NGS) är en teknik som används för att bestämma sekvensen av genetiskt material (DNA eller RNA) för att få insikt i den genetiska variationen som är förknippad med olika sjukdomar och biologiska fenomen. Före tillkomsten av NGS användes Sanger-sekvenseringstekniken för att bestämma DNA-sekvensen. Men på grund av Sanger-sekvenseringens begränsningar i genomströmning och relativt höga kostnader, var det svårt att sekvensera ett stort DNA/RNA-prov. NGS-tekniken utvecklades för att övervinna bristerna med Sanger-sekvensering. NGS-teknologier kan parallellt sekvensera tusentals DNA-molekyler samtidigt med hög genomströmning och hastighet^{? 1?}.

Onkologer söker ofta efter specifika mutationer under cancerbiopsi eftersom de kan hjälpa till att identifiera viktiga mål för riktad terapi och specifika behandlingsalternativ bland cancerpatienter. Olika typer av cancerspecifika mutationer observeras för olika cancertyper. Olika cancertyper skiljer sig också åt i antalet potentiella målmutationer. Tidigare behövde flera tester utföras för att upptäcka ett fåtal sådana riktade mutationer i cancer, vilket var både tidskrävande och kostsamt. Ytterligare forskning inom personlig medicin och cancerspecifik behandling har lett till identifiering av potentiellt viktiga målmutationer för olika cancertyper. I detta scenario är NGS tekniken som gör det möjligt för läkare att testa många cancerspecifika gener samtidigt. NGS-test kan utföras från olika typer av prover, vilket inkluderar tumör- och blodprover från cancerpatienter. NGS-test kan också utföras från en mycket liten mängd DNA isolerat från cirkulerande cancerceller i patientens blodprov^{? 2?}.

Olika NGS-plattformar

För närvarande finns det olika NGS-plattformar kommersiellt tillgängliga: Illumina Miseq och Hiseq, Roche 454 GS, Ion torrent och Life Technologies SOLiD^{? 3?}. Vissa NGS-plattformar, som Ion torrent och Illumina Miseq, är mer gynnsamma för klinisk användning på grund av deras kortare körtid och ökade flexibla genomströmning.

Typer av NGS genetisk testning

Helgenomsekvensering

Helgenomsekvensering innebär sekvensering av patientens hela genom och kartläggning av det tillbaka till den mänskliga genomdatabasen för att upptäcka mutationer. Den största fördelen med helgenomsekvensering involverar sekvensering av hela genomet, inklusive både kodande (regioner som översätts till proteiner) och icke-kodande regioner (regioner som inte översätts till protein men har regulatoriska funktioner) av DNA-sekvensen. Därför används helgenomsekvensering mest för att identifiera sällsynta och nya mutationer^{? 3?}.

Hel-exom-sekvensering

Vid helexomsekvensering sekvenseras exonerna (regioner som översätts till mRNA) av alla kända gener samtidigt. Den betydande fördelen med exomsekvensering jämfört med helgenomsekvensering är att det är kostnadseffektivt och mindre tidskrävande. Hel-exom-sekvensering används ofta för identifiering av cancerassocierade gener^{? 4?}.

Transkriptomsekvensering

Transkriptomsekvensering, även kallad RNA-seq, involverar sekvensering av cDNA (komplementärt DNA)-fragment som genereras genom omvänd transkription av RNA. Kliniker kan bestämma RNA-expressionsprofilen och splitsningsprofilen baserat på transkriptomsekvenseringsresultat.

Epigenetisk analys

Epigenetisk analys är en framväxande tillämpning av NGS som används för att karakterisera epigenetik i cancer. Den potentiella diagnostiska och prognostiska tillämpningen av DNA-metylering och protein-DNA-bindningsprofiler har visat sig förstå utvecklingen av olika cancertyper^{? 5?}.

Fördelar och nackdelar med NGS testa

Det finns många fördelar och nackdelar med NGS-baserad genetisk testning i jämförelse med den traditionella genetiska testmetoden för individuella markörer.

Fördelar med NGS-test

• NGS kan användas för att testa många gener samtidigt, vilket sparar pengar, tid och patientprover.
• NGS kan hjälpa till att upptäcka mutationer som behövs specifikt och hjälpa till att identifiera nya markörer som kan ge ytterligare behandlingsalternativ.
• Genetisk testning att använda NGS erbjuder en bred samling av markörer för forskare och kliniker, vilket kan hjälpa till att identifiera nya mönster av patienternas svar.

Nackdelar med NGS-test

NGS lämpar sig inte för studier av en enda markör eftersom det tar längre tid jämfört med tekniker utformade för analys av individuella markörer.

NGS är betydligt dyrare för att studera enstaka eller få markörer jämfört med tekniker utformade för individuell markörstudie.

NGS-resultat är vanligtvis svåra att tolka. Därför kan en felaktig tolkning av NGS-resultatet leda till felaktiga behandlingsbeslut som kan skada patienten^{? 2?}.

Vem ska få NGS-testning?

Innan du går till något test måste testets betydelse i behandlingsregimen undersökas noggrant. Om testet inte har någon betydande roll i behandlingsresultatet är det inte tillrådligt att utföra testerna, särskilt om det berörda testet är tidskrävande, invasivt och kostar högt. NGS genetisk testning är mer lämplig för vissa cancertyper där flera molekylära markörer vanligtvis observeras. För cancertyper kan NGS hjälpa till att identifiera mutationer som är associerade med ett nytt behandlingsalternativ för patienten; dock är oddsen för detta vanligtvis mycket låga^{? 2?}.

Tillämpning av NGS i klinisk onkologi

Identifiering av nya cancermutationer

NGS-teknologier har underlättat noggrann och effektiv detektering av sällsynta och nya somatiska mutationer. Användningen av NGS-test i cancerforskning har framgångsrikt hjälpt till att identifiera nya mutationer i olika cancertyper, inklusive njurcellscancer, blåscancer, småcellig lungcancer, akut myelogen leukemi, prostatacancer och kronisk lymfatisk leukemi. Helgenom- och helexomsekvensering har hjälpt till att identifiera olika nya och sällsynta genetiska mutationer och de associerade potentiella terapeutiska målen för cancertyper^{? 6?}.

NGS vid genetisk testning av ärftligt cancersyndrom

Nästan 5%10% av alla cancertyper är ärftliga. I USA och Europa, i mer än tio år, har genetiska tester rutinmässigt använts för ärftliga cancerpatienter^{? 7?}. Utvecklingen av NGS öppnade många möjligheter för genetisk testning. NGS tillhandahåller en lovande lösning för detektering av sällsynta genetiska avvikelser. NGS förbättrar avsevärt variationsdetekteringshastigheten på grund av dess förmåga att leta efter flera gener samtidigt. Många ärftliga cancerpatienter rapporterades negativa för genetiska avvikelser, men med NGS var det lättare att identifiera de orsakande mutationerna. Användningen av NGS för ärftliga cancersyndrom kan snart hitta sin användning i klinisk praxis. Data som erhållits med hjälp av hel-genom- eller hel-exom-sekvensering av olika maligna tumörer har använts i olika personliga kliniska prövningar för cancerterapi^{? 6?}.

NGS-test för personlig cancerbehandling

Förutom att identifiera somatiska och nya genetiska mutationer, kan NGS också förbättra personlig medicin för cancerbehandling. Många studier har använt NGS för att utveckla personlig cancerbehandling. Till exempel användes NGS-test för cancer för att behandla cancer i bukspottkörteln. Det användes också vid icke-småcellig lungcancer för att detektera epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), som visade sig ha betydande kliniska och patogenetiska implikationer för icke-småcelliga lungcancerpatienter. Dessutom användes NGS även för att detektera PML-RARA fusionsgenen hos patienter med akut promyelocytisk leukemi, vilket hjälpte till att modifiera det terapeutiska schemat för cancerpatienter. Studier har visat de praktiska kliniska tillämpningarna av NGS vid cancerbehandling^{? 6?}.

Detektering av cirkulerande cancer-DNA

NGS-testet har länge använts för att upptäcka somatisk mutation och genetisk variation i det cirkulerande DNA:t från cancerpatienters blod för effektiv hantering och diagnos av cancer. Tumörsuppressorgener som TP53 är mycket muterade hos cancerpatienter, och sällsynta mutationer i denna gen är mycket svåra att upptäcka och identifiera. NGS fungerar som en kostnadseffektiv metod för att upptäcka sådana mutationer i TP53 gen^{? 6?}.

När bör ett NGS-test övervägas kliniskt?

Många forskare stöder en konservativ metod för genetisk testning av cancer. De har föreslagit att man endast använder NGS-tester i kliniska prövningar eller kontrollerade forskningsmiljöer. Däremot har många andra föreslagit rutinmässig användning av NGS för genetisk testning för patienter med metastaserande cancer. Följande är de områden där användningen av NGS kan tillskrivas i kliniska miljöer.

Multitestning

För vissa cancertyper, såsom avancerad icke-småcellig lungcancer, beror den första raden av cancerbehandling på den genetiska statusen hos flera molekylära markörer. NGS kan användas i ett sådant sammanhang för att upptäcka och identifiera flera genetiska förändringar och för att få information om patientanpassad cancerterapi. Att de flesta tillgängliga prover för behandling av avancerad lungcancer har låg tumörcellhalt (patienter diagnostiseras vanligtvis med små biopsier) är av stor betydelse i detta fall. NGS kan också hitta sin tillämpning i andra typer av tumörer för vilka multipel screening är nödvändig, såsom melanom (BROR, KIT) eller kolorektal cancer (RAS, BRAF).

Sällsynta molekylära förändringar

Ett annat skäl till att stödja användningen av NGS genetisk testning vid lungcancer är att sällsynta molekylära förändringar som förekommer i andra cancerformer också kan förekomma i en liten del av NSCLC, såsom de som är lämpliga för tumöragnostisk eller transversell behandling med NTRK TKI, transversal eller mikrosatellit instabilitet, NGS underlättar testningen av dessa ytterligare och sällsynta biomarkörer. Därför blir integreringen av genomiska markörer allt viktigare för behandlingen av cancerpatienter. NGS kan också vara mycket användbar för att identifiera genetiska svar på läkemedel mot cancer eller personliga terapier.

Sällsynta cancerformer

Sällsynta cancertyper ses ofta hos ett litet antal patienter, och ofta föreskrivs ingen vanlig andrahandsbehandling. På grund av deras sällsynthet studeras dessa maligniteter ofta inte i konventionella fas 3 kliniska prövningar för att fastställa värdet av nya behandlingar. Några exempel är sarkom, gallvägscancer, mesoteliom och cancer av oidentifierat primärt ursprung. Vid sällsynta maligniteter ger majoriteten av mutationer som upptäcks med NGS ingen klinisk nytta för patienterna. Kliniska prövningar baserade på NGS-data kan dock ge behandlingsalternativ till prövningsläkemedel för patienter med begränsade behandlingsalternativ.

Kliniska prövningsnätverk

Användningen av NGS och precisionsmedicin kan hjälpa patienter att få personlig cancerbehandling. Naturligtvis kräver detta nya kliniska prövningsdesigner och organiserade kliniska prövningsnätverk. Det finns för närvarande oöverträffade framsteg i utvecklingen av kliniska prövningar för cancer i tidiga skeden i form av adaptiva studier som använder NGS-baserade kliniska prövningsdesigner för att optimera biomarkörer och läkemedelssamutvecklingsprocesser.

Klinisk bedömningsorienterad testning

Eftersom NGS-testning ofta inte är vägledande bör därför klinisk bedömning föregå molekylär testning hos cancerpatienter. I allmänhet bör NGS-testning inte rekommenderas till patienter om inte genomiska testresultat har en viktig effekt på den kliniska behandlingen av cancerpatienter. Somatiska genpaneler krävs till exempel vanligtvis inte hos patienter i tidigt stadium som får slutlig behandling. De kommer inte att ha effektiva NGS-medierade förändringar utöver vad som kan fastställas från standardbedömningar (ER, PR, HER2 för bröstcancer). Patienter med snabbt växande cancer, dålig prestationsstatus eller patienter med en förväntad livslängd på mindre än tre månader bör inte molekylärt profileras. Dessa patienter kommer med största sannolikhet att remitteras till palliativ vård^{? 3?}.

Framtiden för NGS-testning vid cancer

NGS är oupplösligt kopplat till implementeringen av precisionsmedicin inom onkologi. I sitt nuvarande tillstånd är det osannolikt att det utesluter konventionell prognos, men det ger en fullständig bild av cancerns patogenes. RNA-sekvensering med hjälp av NGS kan ge information om det relativa uttrycket av muterade gener. Vidare finner immunterapi alltmer sin betydelse vid cancerterapi, särskilt vid melanom^{? 8?}. NGS-sekvensering kan vara av stor betydelse för att förutsäga svar på immunterapi. Exomsekvensering kan kombineras med masspektrometri för att bestämma vilka neoantigener som effektivt presenteras av det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC)^{? 9?}.

Referensprojekt